Piloty war zunächst Schüler seines Vaters, des Lithographen Ferdinand Piloty d. Ä. Ab 1840 studierte er an der Münchner Akademie bei Julius Schnorr v. Carolsfeld und Karl Schorn. Deutlichen Eindruck machte auf ihn die Ausstellung der Antwerpener Historienmalerei 1842 in München. 1847 und 1852 unternahm Piloty Studienreisen nach Venedig, Brüssel, Antwerpen und Paris, wo er sich für Paul Delaroche begeisterte. Mit seinem großformatigen Historienbild "Seni vor der Leiche Wallensteins", 1855 (Neue Pinakothek München), gelang ihm der Durchbruch. Er wurde Professor und 1874 Direktor der Akademie als Nachfolger Wilhelm v. Kaulbachs. Er verschaffte dem französisch-belgischen Kolorismus Eingang in die Münchner Schule, die nun zu einem Zentrum der realistisch-dramatischen Historienmalerei wurde.
Piloty bevorzugte in seinen meist großformatigen Historiengemälden bei größter historischer Treue in Kostüm und Beiwerk theatralische und pathetische Kompositionen. Seine bravouröse Technik machte ihn zum anerkannten Lehrmeister der bedeutendsten Künstler seiner Zeit, wie Franz Defregger, Hans Makart und Franz v. Lenbach.

Thieme-Becker 27 (1933), S. 47; Ausst.-Kat. München 1979 Haus der Kunst, S. 318-321; Bruckmann 1981-1983 3, S. 283-287; C. Härtl-Kasulke, Karl Theodor Piloty (1826-1886). Karl Theodor Pilotys Wege zur Historienmalerei 1826-1855. (Mit einem kommentierten Katalog seiner Historienbilder), München 1991; Ausst.-Kat. München 2003